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© H. Raguet/CNRS Photothèque

Chacune des 96 pointes de ce robot prélève une colonie bactérienne qui possède un fragment de l'ADN à séquencer et l'introduit dans une plaque de 96 puits remplis de milieu nutritif.

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Le 5 avril 2006, Jean Weissenbach, directeur du Centre national de séquençage, ou Genoscope, annonçait la publication du séquençage d'une bactérie-clé dans le fonctionnement des stations d'épuration, Kuenenia stuttgartiensis. Une reconversion étonnante pour le prestigieux organisme de recherche, qui depuis 1997 participait à l'ambitieux programme international de séquençage du génome humain. Une visite sur place en banlieue parisienne s'imposait pour comprendre pourquoi les bactéries investissent dorénavant ces lieux ! Direction Évry-Courcouronnes, site d'implantation du Genoscope. Là, Jean Weissenbach et Denis Le Paslier, responsable du programme Cloaca maxima, s'expliquent.

« Depuis 2003, le séquençage du génome humain est quasi fini. Il reste à compléter la collection des variations de séquence dans les populations humaines. Un projet très important pour les pathologies, mais auquel le Genoscope ne participe pas », confirme le directeur. Que faire alors après avoir séquencé les 87 millions de nucléotides du chromosome 14 ? Comment occuper le matériel ultrasophistiqué – les multiples robots de repiquage de cellules et les séquenceurs automatiques bien alignés dans la grande pièce du deuxième étage – de ce grand équipement au service de la recherche publique (voir encadré ci-dessous) ? À côté de projets purement Genoscope, le salut vient en 2000 de Denis Le Paslier, qui propose le programme Cloaca maxima. Avec comme objectif l'exploration génomique de cette terra quasi incognita qu'est la biosphère microbienne pour, à terme, trouver des solutions aux problèmes tels que l'épuisement progressif des combustibles fossiles, l'effet de serre, l'accumulation de polluants…

Les latinistes auront fait le lien entre le nom de ce programme et le système d'égout de la Rome antique. Eh oui, Cloaca maxima va recenser et séquencer les bactéries des boues de stations d'épuration. « C'est la diversité des bactéries qui vivent dans ces milieux qui nous intéresse… Nos connaissances sur leur métabolisme ne sont fondées que sur les bactéries cultivables, soit certainement moins de 1 % de celles présentes dans le milieu naturel ! » Les microbiologistes ne parviennent pas en effet à cultiver sur un milieu artificiel de nombreuses bactéries, soit parce que leur source d'énergie et leurs conditions de croissance sont méconnues, soit parce qu'elles ne vivent qu'en symbiose ou en syntrophie ¹ avec d'autres… Difficile donc de les étudier autrement que par une approche « métagénomique », c'est-à-dire en analysant les génomes de tous les organismes présents dans leur niche écologique. Voilà pourquoi les chercheurs ont pensé tout naturellement à la station d'épuration d'Évry, « un écosystème complexe fait de polluants, de matières organiques…, où l'on trouve un très grand nombre de bactéries différentes ». Première étape du programme Cloaca maxima donc : analyser les ADNr 16S ² de ces communautés bactériennes, pour avoir une idée de leur diversité. Sorte de carte d'identité des bactéries, les ADNr 16S sont en effet spécifiques à chaque espèce.

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© H. Raguet/CNRS Photothèque

Découpe d'une bande de gel contenant des fragments d'ADN provenant du génome étudié. Ils seront insérés dans une bactérie qui les multipliera. Le séquençage consistera à identifier l'enchaînement des nucléotides.

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un séquençage délicat  

C'est à cette étape du programme que nos chercheurs s'associent avec les laboratoires de Michel Wagner ³ et de Mike Jetten ⁴ – cosignataires de la publication concernant Kuenenia stuttgartiensis – sur un projet parallèle. « Ils avaient réussi à obtenir une culture enrichie dans laquelle K. stuttgartiensis était majoritaire à 70 % et les 30 % restants étaient constitués d'autres bactéries, explique Denis Le Paslier. Ils nous ont demandé si l'on pouvait reconstituer le génome de K. stuttgartiensis. » Défi accepté par nos chercheurs, car le séquençage de cette bactérie présentait pour eux un double intérêt : « D'abord c'était un bon exercice de préparation pour Cloaca maxima, confirment-ils. Et cette bactérie, présente dans les stations d'épuration, joue un rôle-clé dans le cycle de l'azote : elle transforme l'ammoniaque et les nitrites en azote gazeux en l'absence d'oxygène », comme les autres bactéries dites anammox.

Mais le séquençage de cette bactérie s'annonçait difficile. En effet, les chercheurs ne connaissaient au départ qu'un seul gène, l'ADNr 16S, soit un seul point d'entrée dans le génome. Pour y parvenir, ils ont donc mis au point une méthode bio-informatique prenant en compte, entre autres, les pourcentages de nucléotides C et G présents dans l'ADN. Pourcentages généralement caractéristiques d'une espèce. Cette technique leur a permis d'isoler les séquences issues du génome de K. stuttgartiensis de celles des autres bactéries présentes dans le milieu de culture. Une première étape primordiale ! Est venu ensuite le tour d'une phase quasi automatisée d'analyse des séquences isolées. Le but ? Annoter le génome de cette bactérie, c'est-à-dire trouver une fonction pour chacun des gènes définis : « Les bactéries de type anammox sont très répandues, annonce Jean Weissenbach. Étudier les voies métaboliques qu'elles utilisent, et donc découvrir les gènes impliqués, permettra peut-être de mieux comprendre le cycle de l'azote, ou encore de mettre au point de nouveaux procédés de biotechnologies, par exemple dans l'épuration des eaux. »

Des bassins de bactéries

Une fois la première bactérie clonée et séquencée et la méthode mise au point, place aux autres bactéries de Cloaca maxima ! Et les chercheurs ont du pain sur la planche, car au moins 80 % des bactéries recensées dans les bassins de la station d'épuration sont inconnues ! D'où l'idée de l'équipe de Denis Le Paslier de construire des banques génomiques (insertion de fragments des génomes dans des clones de bactéries, voir encadré ci-dessous), à partir des communautés de bactéries vivant dans deux des bassins. « Ce travail un peu pénible nous a pris deux ans. Maintenant, nous en sommes à la partie séquençage ! » Les chercheurs en sont même plus loin : ils sont bientôt prêts à publier la reconstruction d'un génome entier d'une nouvelle bactérie faisant partie d'un groupe encore complètement inconnu…

Mais les interventions du Genoscope dans le monde microbien ne se limitent pas à Cloaca maxima. Les chercheurs se sont également penchés sur l'étude génomique de la bactérie Acinetobacter. « Elle n'est pas très éloignée d'E. coli, la bactérie modèle des généticiens, mais offre l'avantage d'être strictement aérobie – elle ne peut pas vivre sans oxygène –, d'être facilement manipulable génétiquement et de ne pas offrir de redondance dans son génome, explique Jean Weissenbach. Pour étudier la fonction de ses gènes, nous avons réalisé une collection d'Acinetobacter mutantes, où pour chacune, un gène différent est inactivé. » Les chercheurs regardent ensuite si les bactéries mutantes sont encore capables de proliférer sur des composés organiques particuliers et donc de les utiliser comme source de carbone. Cela leur permet entre autres de découvrir des enzymes encore inconnus du métabolisme du carbone. À l'heure où le pétrole et les sources d'énergie fossiles se tarissent, découvrir de nouveaux procédés de synthèse biochimique utilisant le carbone de la biomasse peut être très prometteur…

Julie Coquart

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© H. Raguet/CNRS Photothèque

Une salle du Genoscope où s'effectue le séquençage.

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Quid du Genoscope ?

Le Genoscope, ou Centre national de séquençage, est un « grand équipement », appartenant au groupement d'intérêt public Consortium national de recherche en génomique. Ce dernier regroupe également le Centre national de génotypage (CNG) et le Réseau national Genopole. Le Genoscope et le CNG, hébergés dans des bâtiments connexes, sont situés sur le Genopole d'Évry. Les autres Genopoles sont situés à Lille, Marseille, Lyon-Grenoble, Montpellier-Languedoc-Roussillon, Toulouse, Strasbourg et dans l'Ouest.

J. C.